Gabinety Stomatologiczne
Zdrowe zeby oraz ich leczenie

Dysfunkcja spinowo-móżdżkowa u dorosłych wywołana mutacją w genie dla białka przenoszącego -tokoferol cd

Posted in Uncategorized  by admin
December 4th, 2018

Sekwencję kodującą .-TTP pacjenta, poza końcami 3 egzonów A i B, określono przez bezpośrednie sekwencjonowanie asymetrycznych produktów PCR z zestawem do sekwencjonowania barwnika-terminatora. Ekspresja in vitro .-TTP w komórkach Cos-7
Konstrukcja bakteryjnego wektora ekspresyjnego niosącego cDNA ludzkiej .-TTP została opisana poprzednio.25 W konstrukcie typu dzikiego, fragment Bglll-BamHI (pozycje 258 do 323) został zastąpiony przez odpowiedni fragment amplifikowany z DNA pacjenta. Po przeniesieniu tych wstawek do ssaczego wektora ekspresyjnego pRc / CMV (Invitrogen, San Diego, CA) skonstruowano 27 wektorów plazmidowych kodujących normalną i zmutowaną ludzką .-TTP. Ich integralność została potwierdzona przez sekwencjonowanie. Komórki COS-7 (8 x 106 komórek w 0,5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem) transfekowano 40 .g każdego konstruktu plazmidu przez elektroporację. Jako eksperyment kontrolny komórki transfekowano 40 .g samego pRc / CMV (pozorowana transfekcja). Cotransfekcja genu reporterowego wykazała, że skuteczność transfekcji była podobna w doświadczeniach z użyciem normalnego i zmutowanego DNA. Po inkubacji przez 68 godzin w 10 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle a Dulbecco zawierającej 10 procent surowicy płodowej, komórki zebrano w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, rozbito przez sonikację i wirowano przy 100 000 xg przez godzinę. Supernatant następnie analizowano pod kątem .-TTP. Te eksperymenty powtarzano trzy razy dla każdego plazmidu.
Analiza Immunoblot i test aktywności .-TTP
Analizę immunoblot i test aktywności .-TTP przeprowadzono jak opisano uprzednio25 z pewnymi modyfikacjami. Analizę immunoblot przeprowadzono z poliklonalnym przeciwciałem wzbudzonym wobec szczurzego .-TTP.24. Test na aktywność .-TTP przeprowadzono z użyciem liposomów zawierających śladową ilość [3H] .-tokoferolu (1,5 x 106 cpm) i nierozpuszczalnego glicerolu tri [ 14C] oleinian. Liposomy zmieszano z 0,5 mg białka frakcji ciężkiej błony przygotowanej z wątroby szczura i inkubowano z 0,5 mg białka komórkowego. Membrany następnie sedymentowano przez odwirowanie i oznaczono radioaktywność supernatantu. Procent [3H] .-tokoferolu przeniesionego z liposomów do frakcji błonowej obliczono jak opisano wcześniej.25
Wyniki
Identyfikacja mutacji genu .-TTP
Ryc. 1. Ryc. 1. Identyfikacja mutacji His101Gln u pacjenta z dysfunkcjami neurologicznymi i niskimi stężeniami witaminy E w surowicy. Panel A pokazuje częściowe sekwencje nukleotydowe nici sensownej eksonu B ludzkiego genu .-TTP od normalnego osobnika i pacjenta. Strzałka wskazuje na nukleotyd guaninowy podstawiony w genie pacjenta. Panel B pokazuje częściowe struktury ludzkiego genu .-TTP i cDNA. Zacieniona część cDNA odpowiada regionowi białka, które koduje 278 aminokwasów. Widoczne są granice egzonów z liczbami oznaczającymi pozycję ostatniego nukleotydu każdego eksonu 5 . Liczby -19, i 834 oznaczają odpowiednio pozycje nukleotydów do inicjacji transkrypcji, inicjacji translacji i zakończenia translacji. Strzałka wskazuje pozycję mutacji
[hasła pokrewne: aparat wunderera, lisinoratio, dyżury aptek radomsko ]

Tags: , ,

Leave a Reply

Powiązane tematy z artykułem: aparat wunderera dyżury aptek radomsko lisinoratio